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(一)ELISA試劑盒AP的底物
AP為磷酸酯酶,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚,在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。
AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光測定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。
(二)ELISA試劑盒HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),代表性的過氧化物為H2O2,其反應(yīng)式如下:
DH2+H2O2D+H2O
上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色,用酸終止酶反應(yīng)后,在492nm處有zui高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCl為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性,操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì),與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中,OPD和H2O2一般分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發(fā)泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色,目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn),因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色,可在比色計(jì)中定量,zui適吸收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些ELISA試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenlypropionicacid,HPPA],經(jīng)HRP作用后,產(chǎn)物顯熒光,可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。
HRP對氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。H2O2應(yīng)用zui多,但尿素過氧化物為固體,作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(2~8℃)可穩(wěn)定1年。