產(chǎn)品列表PROUCTS LIST
新聞動(dòng)態(tài)NEWS
- 小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）elisa試劑盒?“八月中旬優(yōu)惠盛宴”
- 如何使用熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
- 血紅素加氧酶ELIS檢測(cè)試劑盒?特惠活動(dòng)
- 羅氏熒光定量試劑盒的儲(chǔ)存條件與操作注意事項(xiàng)
- 豬肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B（SP-B）elisa試劑盒?的夏季優(yōu)惠活動(dòng)
- 卡他莫拉菌LAMP試劑盒新品上架七月優(yōu)惠
- 大鼠微纖絲相關(guān)糖蛋白3（MFAP3）elisa試劑盒優(yōu)惠
- 接觸蛋白相關(guān)蛋白樣4ELISA檢測(cè)試劑盒優(yōu)惠
- 評(píng)估IRF1 ELISA定量試劑盒性能的方法
- 小鼠抗Ⅲ抗體（AT-Ⅲ）elisa試劑盒?年中大促
實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的常見(jiàn)問(wèn)題及解決策略
點(diǎn)擊次數(shù)：557 更新時(shí)間：2024-06-25
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，簡(jiǎn)稱qRT-PCR）技術(shù)，因其高靈敏度、高特異性和高定量準(zhǔn)確性，已成為分子生物學(xué)研究中不可少的工具。然而，在實(shí)際使用過(guò)程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒經(jīng)常會(huì)遇到一些常見(jiàn)問(wèn)題，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文將對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行梳理，并提出相應(yīng)的解決策略。
一、常見(jiàn)問(wèn)題
1.無(wú)CT值（信號(hào)）出現(xiàn)
無(wú)CT值出現(xiàn)是qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中最為常見(jiàn)的問(wèn)題之一?？赡艿脑虬ǎ悍磻?yīng)循環(huán)數(shù)不足、檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤、引物或探針降解、引物或探針設(shè)計(jì)不合理、模板量不足或模板降解等。
2.CT值出現(xiàn)過(guò)晚
CT值出現(xiàn)過(guò)晚通常意味著PCR擴(kuò)增效率較低?？赡艿脑虬ǎ簲U(kuò)增效率低、PCR反應(yīng)過(guò)程中退火及延伸的時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)、MgCl2濃度不合適、循環(huán)數(shù)設(shè)置不足、引物或探針設(shè)計(jì)有誤等。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳
標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳通常意味著PCR反應(yīng)中存在不穩(wěn)定因素，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量準(zhǔn)確性。可能的原因包括：加樣存在誤差、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解等。
二、解決策略
1.針對(duì)無(wú)CT值出現(xiàn)的解決策略
?。?）確保反應(yīng)循環(huán)數(shù)足夠。一般而言，循環(huán)數(shù)應(yīng)設(shè)置在35至45個(gè)之間，避免背景信號(hào)過(guò)高影響結(jié)果。
（2）檢查熒光信號(hào)檢測(cè)步驟是否正確。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書或?qū)嶒?yàn)方法，確保在正確的PCR反應(yīng)步驟中采集熒光信號(hào)。
?。?）通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解。若發(fā)現(xiàn)降解現(xiàn)象，應(yīng)重新制備引物和探針。
?。?）優(yōu)化引物和探針的設(shè)計(jì)。根據(jù)目的基因的特性，設(shè)計(jì)合適的引物和探針，避免引物跨越內(nèi)含子或探針設(shè)計(jì)在擴(kuò)增片段的5'端等可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。
（5）確保模板量足夠且未降解。對(duì)于未知濃度的樣品，應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起，避免模板量不足導(dǎo)致無(wú)CT值出現(xiàn)。同時(shí)，注意樣品的儲(chǔ)存條件，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致模板降解。
2.針對(duì)CT值出現(xiàn)過(guò)晚的解決策略
?。?）優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。如適當(dāng)降低退火溫度、調(diào)整延伸時(shí)間等，以提高PCR擴(kuò)增效率。
?。?）檢查MgCl2濃度是否合適。按0.5mM的間距調(diào)整MgCl2的濃度，找到適合本實(shí)驗(yàn)條件的濃度。
?。?）重新設(shè)計(jì)引物和探針。若引物或探針設(shè)計(jì)不合理，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，應(yīng)重新設(shè)計(jì)并優(yōu)化。
（4）確保PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度合適。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一般應(yīng)在80至150bp之間，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都可能影響擴(kuò)增效率。
3.針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳的解決策略
?。?）確保加樣準(zhǔn)確。注意每次加樣的一致性及移液器的校正，避免加樣誤差導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳。
（2）確保標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量穩(wěn)定。避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存導(dǎo)致降解，應(yīng)重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在使用過(guò)程中可能會(huì)遇到各種問(wèn)題，但通過(guò)仔細(xì)排查原因并采取相應(yīng)的解決策略，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
上一篇 Y190感受態(tài)細(xì)胞100ul操作注意事項(xiàng) 下一篇 小鼠酸性磷酸酶（ACP）ELISA試劑盒?洗滌方法